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冻存袋的基本原理

利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%．15%的甘油或DMSO，可使溶液冰点降低，加之在缓慢***条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

冻存袋细胞复苏操作步骤

1.操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

2.自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

3.将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

4.取出冷冻管，立即放入3℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以7O%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

5.取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15)，混合均匀，放入培养箱培养。取0.1m1解冻细胞悬浮液作存活测试。

6.解冻后是否立即去除冷冻保护剂，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10m1培养基之离心管内，离心 1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入培养箱培养。

使用冻存袋的方法

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但好为对数生长期细胞。在冻存前一天好换一次培养液；将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免；